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基于人源Cdc25C卵白交融表达研讨

2013-06-26 14:31 泉源:生物医学论文 人到场在线征询

资料与办法

1.资料:MCF-7细胞由本实行室保管;感觉态大肠杆菌DH5α、BL21及质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技无限公司;DMEM培育基购自GIBCO生物公司;胎牛血清为杭州江滨公司产物;ImPro-II逆转录试剂盒购自Promega公司;限定性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ购自NEB公司;谷胱甘肽琼脂糖珠4B购自AmershamPharmaciaBiotechnology公司;辣根过氧化物酶标志的GST抗体、Cdc25C磷酸酶底物3-OMFP购自Sigma公司;引物分解和测序由北京奥科生物技能无限公司完成。

2.MCF-7细胞培育及总RNA提取:用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培育基,于37℃、5%CO2培育箱中培育MCF-7细胞。搜集MCF-7细胞,计数,在约5×106细胞中参加350μLRLT裂解液,充沛混匀后参加等体积的70%乙醇,混匀并转移至RNA吸附柱中,8000r/min离心15s,弃上清液;参加700μLRW1液,8000r/min离心15s,弃上清液;参加500μLRPE液,8000r/min离心15s,弃上清液,反复1次;将吸附柱转移到一个新的2mL的离心管中,最大转速离心1min后参加30~50μL不含RNase的水,最大转速离心1min后,将RNA洗脱至1.5mL的EP管中。

3.RT-PCR扩增cdc25c基因:接纳ImPro-II逆转录试剂盒,取1μgRNA为模板,以oligo(dT)15和随机引物逆转录分解cDNA(反响条件:25℃5min,42℃1h)。70℃、15min灭活反响体系中的逆转录酶和RNase克制剂。以该cDNA为模板,以正向特异性引物5'-GCGGGATCCATGTCTACGGAACTCTTCTCATC-3'(含BamHⅠ酶切位点)、反向引物5'-ATTCCGCTCGAGTCATGGGCTCATGTCCTTCACC-3('含XhoⅠ酶切位点)扩增cdc25c基因序列。将PCR扩减产物及载体pGEX-4T-1辨别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后衔接,转化大肠杆菌感觉态DH5α,挑选阳性克隆停止酶切判定。

4.GST-Cdc25C卵白的诱导表达:将pGEX-GST-Cdc25C质粒转化大肠杆菌感觉态BL21,接种至氨苄西林抗性的LB培育基中,37℃、200r/min培育至D600nm为0.6~0.8,参加IPTG至终浓度为1mmol/L,12℃、200r/min培育6~8h,播种菌体,超声波高温破裂菌体,离心后取上清,参加4×SDS上样缓冲液[200mmol/LTris-HCl(pH6.8),8%SDS,4%溴酚蓝,40%甘油、10%β-巯基乙醇],滚水浴5min,将样品停止SDS-PAGE。

5.GST-Cdc25C卵白的纯化:在菌体上清中参加谷胱甘肽(GSH)琼脂糖珠4B,4℃旋转孵育2h,1000r/min离心,弃上清,用PBS缓冲液洗3次,备用;辨别向联合GST的GSH琼脂糖珠、与GST-Cdc25C联合的GSH琼脂糖珠中参加1×SDS上样缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH6.8),2%SDS,1%溴酚蓝,10%甘油、2.5%β-巯基乙醇],滚水浴5min,离心后取上清停止SDS-PAGE。

6.免疫印迹剖析:SDS-PAGE完毕后,将胶用半干转膜法转移到PVDF膜上,用含5%脱脂奶粉的PBST室温封锁1h,参加浓缩的辣根过氧化物酶标志的GST抗体,室温孵育1h,用PBST洗膜3次,每次5min,最初将含有辣根过氧化物酶底物的ECL滴加到膜上,在暗室中停止X线胶片显影。

7.磷酸酶活性剖析:在300μL磷酸酶反响缓冲液[50mmol/LTris-HCl(pH8.0),50mmol/LNaCl,1.0mmol/LEDTA,5mmol/LDTT,0.1%BSA]中辨别参加1μg纯化的GST卵白和GST-Cdc25C卵白,随后参加Cdc25C的磷酸酶底物3-OMFP(终浓度150μmol/L),37℃温育,用荧光分光分度计在490nm激起光波长、530nm发射光波优点检测反响产品的荧光强度,荧光强度值的添加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。

后果

GST-Cdc25C交融表达质粒的构建:为了取得cdc25c基因,我们起首提取了MCF-7细胞总RNA,用RT-PCR逆转录取得MCF-7cDNA库,并用cdc25c特异性引物从cDNA库中扩增取得cdc25c基因,PCR产品电泳判定后果见图1。测序后果标明,该PCR产品序列与cdc25c基因序列(GenBankNo.BC019089)分歧。随后,经过BamHⅠ和XhoⅠ限定性酶切位点将cdc25c基因的PCR产品克隆至pGEX-4T-1载体上,GST-Cdc25C交融表达阳性克隆双酶切判定后果如图1所示。

GST-Cdc25C交融卵白的表达及纯化:用大肠杆菌BL21感觉态细胞表达GST-Cdc25C交融卵白,诱导表达条件为高温12℃、6~8h。搜集菌体,于15mL冰浴的PBST(含卵白酶克制剂1片/25mL)中超声波破裂4min,使可溶性GST-Cdc25C交融卵白开释到上清液中。SDS-PAGE后果标明,与GST比较组相比,在绝对分子质量约87×103地位呈现了明显条带(图2A),与GST-Cdc25C卵白的绝对分子质量分歧,阐明GST-Cdc25C在大肠杆菌BL21中取得了可溶性表达。随后,用GSH琼脂糖珠与裂解上清混匀,4℃旋转孵育2h,离心失掉纯化的绝对分子质量为87×103的GST-Cdc25C交融卵白,并存在肯定水平的降解。免疫印迹实行进一步标明,GST-Cdc25C交融卵白及GST比较卵白均取得表达及纯化(图2B)。

GST-Cdc25C的磷酸酶活性剖析:以3-OMFP为Cdc25C磷酸酶反响底物,在磷酸酶活性反响体系中辨别参加1μgGST和GST-Cdc25C交融表达卵白,37℃温育,每隔5min用荧光分光分度计检测反响产品的荧光强度,荧光强度添加速率代表Cdc25C的磷酸酶活性。用荧光强度值绝对工夫变革画图,后果如图3,与GST卵白相比,参加GST-Cdc25C交融卵白的反响体系的荧光值明显降低且速率波动(根本呈线性),阐明原核表达的GST-Cdc25C具有明显的波动的磷酸酶活性。

讨论

在乐成钓取人源cdc25c全长基因的根底上,我们表达纯化了具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C交融卵白。由于GST-Cdc25C在表达进程中容易构成自然二硫键,易招致包容体的构成,且构造的不波动添加,因而存在肯定水平的降解。Cdc25C在调控细胞周期G2/M转换进程中有紧张作用,其磷酸酶活性关于激活Cdc2/周期卵白B复合体,开启细胞有丝破裂历程至关紧张。现在发明的Cdc25C下游调理分子次要经过互相作用及磷酸化或泛素化修饰调理Cdc25C的磷酸酶活性及亚细胞定位,进而影响细胞周期的历程。本研讨中,我们表达纯化出具有磷酸酶活性的GST-Cdc25C交融卵白,为研讨c-Abl酪氨酸激酶经过Cdc25C调控G2/M转换的分子机理提供了根底。(本文图略)

本文作者:张鹏 刘萱 曹诚 单元:北京军事医学迷信院 生物工程研讨所 

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