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低聚糖对乳酸菌抗氧化胁迫的影响研讨

2013-05-23 11:47 泉源:养分学论文 人到场在线征询

资料与办法

1.资料与仪器

保加利亚乳杆菌(L.bulgaricusFn009)本实行室保管;GOS、XOS本实行室提供;PI(碘化丙啶)sigama公司;DTNB(二硝基苯甲酸)sigama公司;H2O2、Vc(抗坏血酸钠)、FeSO47H2O、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、MTT(噻唑蓝)、二甲亚砜、柠檬酸三钠、叠氮钠、GSH(复原型谷胱甘肽)、偏磷酸等试剂均为国产剖析纯。总超氧化物酶比方化酶(T-SOD)试剂盒南京建成生物工程研讨所。Delta320pH计上海梅特勒-托利多仪器无限责任公司;FA1004A电子天平上海精天电子仪器无限公司;超等恒温水浴箱上海市化学仪器总厂;5804R型台式高速冷冻离心机德国艾本德生物技能无限公司;QL-901漩涡混匀器江苏海门其林医用仪器厂;MultiskanMk3酶标仪美国Thermo公司;立式主动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗仪器仪表厂;超净任务台苏净团体安乐公司;FACSCalibur流式细胞仪美国BD公司;隔水式恒温培育箱上海市跃进医疗东西厂;微量分光光度计spectrophotometer上海琪特剖析仪器无限公司;7900HTfast及时荧光定量PCR仪美国ABI公司。

2.实行办法

1).乳酸菌活化:实行室甘油保管(-70℃)的乳酸菌接种到MRS琼脂培育基活化,挑取单菌落接种于MRS液体培育基深层培育留宿(18h,37℃)。2).乳酸菌耐H2O2才能的测定:播种培育至12h的乳酸菌菌体,应用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)洗濯三次,重新悬浮在PBS中调解菌体浓度至107CFU/mL。取5mL菌悬液滚水浴15min,制备去世菌悬浮液作为阴性比较组。按表1参加试剂,37℃孵育,每隔2h取100μL菌悬液参加96孔板,参加5mg/mL的MTT20μL,振荡混匀37℃反响2h,参加100μL二甲亚砜混匀后测定OD570nm吸光度。3).FCM检测乳酸菌细胞膜完好性:乳酸菌在MRS培育基上发酵至对数中期,搜集菌体,调解浓度至106CFU/mL。实行分组及试剂添加次序同表1(H2O2终浓度:2mM;低聚糖终浓度为20mg/mL),置于37℃孵育2h后离心搜集沉淀,参加PI溶液,终浓度为50μg/mL,冰浴避光染色30min,下流式细胞仪测定,在488nm激起光激起下,波长630nm处检测荧光信号。以相反浓度活菌悬液设“门”,FL2-H表现荧光强度,Counts表现细胞频数,M1表现细胞膜完好的细胞比率,M2表现细胞膜破坏的细胞比率,每个样品搜集10000个细胞,用CellQuest软件停止数据剖析。4).乳酸菌抗氧化酶活测定:配制新颖的MRS培育基记为H2O2组,以GOS和XOS辨别代替20%葡萄糖的MRS培育基记为H2O2+GOS组和H2O2+XOS组;在MRS培育基中添加0.01%Vc记为H2O2+Vc组,辨别接种1%乳酸菌,培育3h后,添加H2O2(终浓度:2mM)树立氧化应激模子,以不添加H2O2的MRS为正常组。发酵至对数中期,4800r/min离心10min,搜集菌体,用PBS洗濯三次,调解菌体浓度为108CFU/mL,300W冰浴超声破裂10min,破裂液10000r/min离心10min,搜集上清,即为无细胞提取物。依照T-SOD试剂盒阐明书测定乳酸菌无细胞提取物超氧化物比方化酶生机(U/mgprot),应用DTNB间接显色法[7]测定无细胞提取物的GSH-Px酶生机(U/mgprot),卵白浓度接纳考马斯亮蓝法[8]停止测定。5).乳酸菌应激卵白基因表达的测定:搜集1.2.4氧化应激模子中发酵至对数中期的乳酸菌菌体,应用121℃灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)水洗濯三次,4800r/min离心10min,搜集菌体,提取RNA。应用荧光定量PCR技能检测氧化应激形态下低聚糖对三株乳酸菌抗氧化胁迫基因和通用应激卵白基因表达程度的影响。本实行所选相干基因的引物由上海捷瑞公司设计并分解,引物序列见表2。6).数据处置与统计剖析运用:SPSS17.0软件停止单要素方差剖析、用Turky法停止多重比拟和差别明显性查验,后果以均匀数规范偏向(XSD)表现。

后果与剖析

1.低聚糖对乳酸菌抵挡H2O2才能的影响:过氧化氢是研讨氧化胁迫的常用介质,乳酸菌对H2O2具有较高的敏理性,近期研讨发明,保加利亚乳杆菌极易蒙受H2O2或其他活性氧(ROS)打击,构成氧化毁伤,形成生长停滞乃至殒命[9-10]。图1表现,乳酸菌在H2O2胁迫下,活菌率不时降落,H2O2孵育8h后活菌率降落至20%左右。GOS和XOS干涉6h后乳酸菌活菌率明显高于相反工夫点的H2O2组(p<0.05),但仍明显低于正常组(p<0.05)。阐明GOS和XOS可以加强乳酸菌对H2O2胁迫的抗逆性,进步氧化胁迫条件下的存活率。

2.氧化胁迫条件下低聚糖对乳酸菌细胞膜完好性的影响:乳酸菌蒙受氧化胁迫时,细胞膜上的卵白质、脂类等容易发作氧化毁伤,细胞膜的完好性和功用性遭到毁坏,终极招致菌体殒命。图2表现,正常组菌体细胞膜完好率为98%,去世菌悬液设置的阴性比较组细胞膜破坏比率为97%,H2O2组乳酸菌PI染色率高达79%,细胞膜完好菌体的比率仅为17%,阐明H2O2胁迫可以形成乳酸菌细胞膜氧化毁伤,细胞完好性遭到毁坏。GOS和XOS干涉组,乳酸菌细胞膜完好率辨别为34%和30%,较H2O2组辨别进步了17%和13%。从以上数据可以看出,GOS和XOS干涉可以削弱H2O2对乳酸菌细胞膜的氧化毁伤水平,对菌体细胞膜具有维护效应。

3.氧化胁迫条件下低聚糖对乳酸菌抗氧化酶生机影响图:3标明,H2O2组乳酸菌的谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)和总超氧化物比方化酶(T-SOD)生机较正常组明显降落(p<0.05),阐明H2O2胁迫可以形成乳酸菌抗氧化酶生机的明显降落(p<0.05)。GOS和XOS干涉后乳酸菌GSH-Px生机较H2O2组均有所降低,但XOS干涉组差别不明显(p>0.05),两者仍低于Vc干涉组和正常组;GOS和XOS干涉后乳酸菌的T-SOD生机较H2O2组明显降低,但仍明显低于Vc干涉组和正常组(p<0.05)。阐明氧化胁迫条件下,GOS和XOS干涉可以进步乳酸菌的抗氧化酶生机,但低聚糖作用结果低于Vc。
2.4H2O2胁迫下低聚糖对乳酸菌应激卵白基因表达程度的影响:乳酸菌在蒙受情况胁迫(如极度温度、pH、浸透压、氧和饥饿等)时,会启动相应的应激感到零碎和应激进攻零碎,诱导相干基因停止调理[11],发生应激维护作用,这些应激反响可以进步乳酸菌在情况胁迫下的存活才能。对乳酸菌的卵白质组学研讨标明,乳酸菌在情况胁迫时可以诱导发生多种应激卵白,此中Dnak、GroEL和Gsp65朋友卵白可以被多种胁迫条件所诱导[12-13],属于通用应激卵白,可以到场DNA和卵白质修复。毁伤修复是抵挡氧化和其他胁迫的根本机制[14]。图4标明,在H2O2胁迫条件下,乳酸菌的应激卵白基因表达量较正常组明显进步(p<0.05),此中,Dnak热激卵白基因表达量上调近80倍,GroEL和Gsp65应激卵白基因表达量辨别上调了20倍和13.3倍,阐明H2O2胁迫可以招致乳酸菌应激卵白基因明显上调(p<0.05)。GOS和XOS干涉后三种应激卵白基因的表达量较H2O2组明显低落(p<0.05),但仍明显高于正常组(p<0.05),阐明GOS和XOS可以削弱H2O2对乳酸菌的氧化胁迫水平,低落乳酸菌的氧化应激反响。

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